Isolamento de aptâmeros ligantes à sequência 3'-UTR do RNA do vírus da dengue

Abstract

Dentre os potenciais métodos moleculares para o diagnóstico e/ou terapêutica de doenças que acometem a saúde humana, tais como a dengue, destaca-se a seleção de ligantes pela utilização da química combinatória, conhecida como SELEX. Nesse método, os ligantes a um alvo são enriquecidos exponencialmente tendo como produto final a obtenção de aptâmeros de DNA ou RNA com elevada especificidade, sendo considerados como anticorpos artificiais. No presente trabalho foi realizado o isolamento de aptâmeros de RNA ligantes à extremidade 3’-UTR (untranslated region) do RNA do vírus da dengue (DENV), por apresentar elementos de RNA conformacionais e funcionais importantes no processo infeccioso. A partir do RNA extraído de células C6/36 infectadas foi feita a transcrição reversa (RT) para produção de cDNA viral (sorotipos 2 e 3) e amplificação por PCR simétrica e/ou assimétrica para a produção do alvo 3’-UTR do DENV, na forma de RNA-like por conter desoxiuridina trifosfatada (dUTP) e biotina na extremidade 5’. A biblioteca randômica de ligantes de RNA foi obtida por sonicação de um pool de DNA genômico humano utilizado como alvo em três PCRs sucessivas sendo que na última reação foi introduzido o promotor da T7 RNA polimerase e cujos fragmentos variaram de 80 a 600-pb. Foram realizados oito rounds de seleção entre alvo e biblioteca utilizando partículas paramagnéticas revestidas com estreptavidina. A cada round, após o período de incubação, os oligonucleotideos não ligantes foram removidos com o auxílio de plataforma magnética, e os ligantes foram eluídos com NaOH. Os ligantes eluídos foram precipitados e submetidos à RT-PCR e transcrição in vitro, finalizando um round de seleção. Para verificar a variabilidade de ligantes, o produto do oitavo round foi clonado e 14 clones foram selecionados aleatoriamente para amplificação. Os resultados demonstraram que os aptâmeros isolados possuem tamanhos distintos, com pesos moleculares estimados variando de 80 a 100-pb. Os dados aqui obtidos indicaram a viabilidade do processo de isolamento de aptâmeros para elementos conformacionais presentes na extremidade 3’-UTR do RNA do vírus da dengue os quais poderão contribuir para pesquisas futuras com foco na prevenção e/ou controle da doença.