Isolamento de aptâmeros ligantes à sequência 3'-UTR do RNA do vírus da dengue
| dc.contributor.advisor1 | Neves, Adriana Freitas | |
| dc.contributor.advisor1Lattes | http://lattes.cnpq.br/2984939300978146 | por |
| dc.contributor.referee1 | Neves, Adriana Freitas | |
| dc.contributor.referee2 | Yokosawa, Jonny | |
| dc.contributor.referee3 | Souza, Eduardo Sérgio de | |
| dc.creator | Silva, Amanda Gabrielle da | |
| dc.creator.Lattes | http://lattes.cnpq.br/5537315249170419 | por |
| dc.date.accessioned | 2016-01-21T07:54:16Z | |
| dc.date.accessioned | 2022-04-26T13:42:41Z | |
| dc.date.available | 2022-04-26T13:42:41Z | |
| dc.date.issued | 2015-09-09 | |
| dc.description.abstract | Considering potential molecular methods for diagnostic and/or therapeutic purpose of infectious human diseases, such as dengue, highlights the systematic evolution of ligands by exponential enrichment, known as SELEX. In this method, ligands to a target are exponentially enriched generating aptamers of DNA or RNA with high specificity, being considered as artificial antibodies. In this work, we aimed to realize the isolation of aptamers binding to 3'-UTR (untranslated region) of the RNA from dengue virus (DENV), because present important conformational structures that act as functional elements into RNA necessary in the infectious process. Total RNA of C6/36 infected cells was extracted, submitted to reverse transcription reaction to obtain viral cDNA (serotypes 2 and 3) and amplified by symmetric and/or asymmetric PCR technique to produce the 3’-UTR from DENV as target, generating RNA-like by containing deoxyuridine triphosphate (dUTP) and biotin in the 5’ region of the target. The random library of RNA ligands was obtained by sonication of a pool from human genomic DNA used in three successive PCR, and in the last reaction was introduced the promoter of T7 RNA polymerase, presenting fragments ranging from 80 to 600-bp. Eight rounds of selection were performed between the target and the library by using paramagnetic particles coated with streptavidin. For each round, after the incubation, the non-ligands were removed by using magnetic platform, and the ligands were eluted with NaOH. The eluted ligands were precipitated, submitted to RT-PCR and transcription in vitro, completing one round of selection. For analysis of variability of ligands, the product obtained from the eighth round was cloned and fourteen clones were randomly selected for amplification. The results demonstrated that the aptamers presented sizes with estimated molecular weights varying from 80 to 100-bp. These data indicated the viability of aptamers isolation against conformational elements present in the 3'-UTR of RNA from dengue virus, which may contribute to future research focusing on prevention and/or control of the disease. | eng |
| dc.description.resumo | Dentre os potenciais métodos moleculares para o diagnóstico e/ou terapêutica de doenças que acometem a saúde humana, tais como a dengue, destaca-se a seleção de ligantes pela utilização da química combinatória, conhecida como SELEX. Nesse método, os ligantes a um alvo são enriquecidos exponencialmente tendo como produto final a obtenção de aptâmeros de DNA ou RNA com elevada especificidade, sendo considerados como anticorpos artificiais. No presente trabalho foi realizado o isolamento de aptâmeros de RNA ligantes à extremidade 3’-UTR (untranslated region) do RNA do vírus da dengue (DENV), por apresentar elementos de RNA conformacionais e funcionais importantes no processo infeccioso. A partir do RNA extraído de células C6/36 infectadas foi feita a transcrição reversa (RT) para produção de cDNA viral (sorotipos 2 e 3) e amplificação por PCR simétrica e/ou assimétrica para a produção do alvo 3’-UTR do DENV, na forma de RNA-like por conter desoxiuridina trifosfatada (dUTP) e biotina na extremidade 5’. A biblioteca randômica de ligantes de RNA foi obtida por sonicação de um pool de DNA genômico humano utilizado como alvo em três PCRs sucessivas sendo que na última reação foi introduzido o promotor da T7 RNA polimerase e cujos fragmentos variaram de 80 a 600-pb. Foram realizados oito rounds de seleção entre alvo e biblioteca utilizando partículas paramagnéticas revestidas com estreptavidina. A cada round, após o período de incubação, os oligonucleotideos não ligantes foram removidos com o auxílio de plataforma magnética, e os ligantes foram eluídos com NaOH. Os ligantes eluídos foram precipitados e submetidos à RT-PCR e transcrição in vitro, finalizando um round de seleção. Para verificar a variabilidade de ligantes, o produto do oitavo round foi clonado e 14 clones foram selecionados aleatoriamente para amplificação. Os resultados demonstraram que os aptâmeros isolados possuem tamanhos distintos, com pesos moleculares estimados variando de 80 a 100-pb. Os dados aqui obtidos indicaram a viabilidade do processo de isolamento de aptâmeros para elementos conformacionais presentes na extremidade 3’-UTR do RNA do vírus da dengue os quais poderão contribuir para pesquisas futuras com foco na prevenção e/ou controle da doença. | por |
| dc.description.sponsorship | Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG | por |
| dc.format | application/pdf | * |
| dc.identifier.citation | SILVA, A. G. Isolamento de aptâmeros ligantes à sequência 3'-UTR do RNA do vírus da dengue. 2015. 65 f. Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2015. | por |
| dc.identifier.uri | http://repositorio.ufcat.edu.br/tede/handle/tede/5135 | |
| dc.language | por | por |
| dc.publisher | Universidade Federal de Goiás | por |
| dc.publisher.country | Brasil | por |
| dc.publisher.department | Regional de Catalão (RC) | por |
| dc.publisher.initials | UFG | por |
| dc.publisher.program | Programa de Pós-graduação em Química (RC) | por |
| dc.rights | Acesso Aberto | por |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ | |
| dc.subject | SELEX | por |
| dc.subject | Ácido ribonucleico | por |
| dc.subject | Aedes aegypti | por |
| dc.subject | DENV | por |
| dc.subject | SELEX | eng |
| dc.subject | Ribonucleic acid | eng |
| dc.subject | Aedes aegypti | eng |
| dc.subject | DENV | eng |
| dc.subject.cnpq | CIENCIAS EXATAS E DA TERRA::QUIMICA | por |
| dc.title | Isolamento de aptâmeros ligantes à sequência 3'-UTR do RNA do vírus da dengue | por |
| dc.title.alternative | Isolation of aptamers ligands to 3'-UTR sequence of the RNA from dengue virus | eng |
| dc.type | Dissertação | por |