Isolamento e caracterização de aptâmeros ligantes à 5’-UTR do genoma viral de SARS-CoV-2

Abstract

O desenvolvimento de tecnologias como o método SELEX voltadas para a investigação de biomoléculas denominadas aptâmeros, vêm sendo aplicadas para fins teranósticos e relacionadas à produção de novos materiais para alvos orgânicos e inorgânicos. Tendo como alvo a região 5’- UTR do genoma do vírus SARS-CoV-2, no presente trabalho foram selecionados aptâmeros de ssDNA. Para a obtenção do alvo 5’-UTR de SARS-CoV-2, a sequência desta região foi inserida no plasmídio pUC18, para a amplificação, por PCR simétrica e assimétrica, e produção do ssDNA contendo biotina complexada na extremidade 5’. De modo semelhante, a biblioteca sintética de ligantes foi produzida por PCR simétrica e assimétrica, para obtenção das fitas de dsDNA e ssDNA, respectivamente, cujos fragmentos selecionados e purificados variaram em tamanho em torno de 100-pb. A seleção iniciou-se com a imobilização do ssDNA 5’-UTRbio de SARS-CoV-2 em uma plataforma magnética, seguida de incubação com a biblioteca de ssDNA contendo potenciais oligonucleotídeos ligantes. Após a retirada das moléculas não ligantes ao alvo, cada round de seleção foi finalizado com a amplificação dos ligantes por PCR, simétrica e assimétrica para o próximo round. Doze rounds de seleção foram realizados e o enriquecimento do pool de ligantes ao alvo foi avaliado por dot-blot, indicando haver afinidade e especificidade destes aptâmeros pela sequência 5’-UTR do SARS-CoV-2. Aptâmeros do décimo segundo round foram sequenciados, apresentando cerca de 23 milhões de sequências dos dados brutos, sendo que doze ligantes foram analisados, in silico, numa caracterização preliminar, dentre os quais o Apta01-5UTR-hCoV-2, Apta03-5UTR-hCoV-2, Apta03’-5UTR-hCoV-2 e Apta07-5UTR-hCoV-2 apresentaram interação com porções do SL 4.5 e SL 5 da 5’-UTR de SARS-CoV-2. Estes resultados indicam que tais aptâmeros anti-SARS-CoV-2 podem ser avaliados como ferramentas teranósticas a partir de sínteses e/ou modificações químicas dos oligonucleotídeos selecionados para realização de testes moleculares e celulares.